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当期目录

    2019年 第52卷 第2期 刊出日期:2019-01-16
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    作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
    脂肪酸环氧化酶SlEPX转基因大豆的表型分析
    郝青婷,张飞,吉夏洁,薛金爱,李润植
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 191-200.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.001
    摘要 ( 193 )?? HTML ( 69 )?? PDF (1237KB) ( 144 )?? 收藏
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    【目的】 植物源环氧化脂肪酸(epoxy fatty acids,EFAs)是生产高值化工产品的优异可再生原材料。EFAs仅在一些野生植物种子中高水平合成和积累,难以规模化利用。通过在普通油料作物大豆(Glycine max (L.) Merr.)发育种子中组装环氧化脂肪酸合成途径,以期实现这类珍稀脂肪酸(unusual fatty acids,UFAs)的商业化绿色生产。【方法】 通过构建琉璃菊(Stokesia laevis)脂肪酸环氧化酶(epoxygenase,SlEPX)基因种子特异表达载体,基于体细胞胚发生的粒子轰击法对大豆(cv. Jack)进行遗传转化,经连续选择和鉴定,获得表型稳定的高代转基因大豆株系。分别运用PCR和实时荧光定量PCR检测外源基因SlEPX的整合及在大豆发育种子中的表达谱。统计分析SlEPX转基因大豆籽粒形态和大小、百粒重以及种子萌发率等表型,应用气相色谱和凯氏定氮法测试种子油脂和蛋白等相关生理生化特性。【结果】 外源基因SlEPX稳定整合于大豆基因组,且能在高代转基因大豆发育种子中正确有效表达。SlEPX转基因大豆种子新合成积累了2.9%的EFAs,相应的亚油酸(18﹕2Δ9,12)含量减低8%。与对照相比,SlEPX转基因大豆种子变长,表皮多皱褶。种子大小测量显示,转基因大豆小粒种子(粒径<4 mm)占比明显增加。转基因与对照大豆的种子发芽率无明显差异,然而转基因植株生长缓慢。转基因大豆种子油脂含量、蛋白质含量和百粒重分别减少5%、6%和8.28%。进一步生化分析发现,转基因大豆新合成的EFAs,绝大部分结合于卵磷脂(phosphatidylcholine,PC,占12.6%)分子,仅少量结合于甘油三酯(triacylglycerol,TAG,占2.3%)。这些数据表明在转基因大豆种子中,外源SlEPX酶能正确催化亚油酸(18﹕2Δ9,12)生成环氧化脂肪酸即斑鸠菊酸(vernolic acid,Va)(12-epoxy-18﹕1Δ9)。但是,绝大多数斑鸠菊酸积累于构成细胞膜的主要成分PC分子中,而没有转移整合进入贮藏的TAG分子。大量新合成的斑鸠菊酸结合于PC分子可能损伤宿主细胞膜稳态和生理反应,导致转基因大豆产生不利表型。【结论】 在大豆发育种子中单独表达外源脂肪酸环氧化酶,能催化合成少量EFAs,但同时产生一些不利表型。在SlEPX转基因大豆种子中共表达DGATPDAT,既可实现环氧化脂肪酸在TAG中富集,同时还能消除环氧化脂肪酸在细胞膜中的积累及其所导致的负效应。

    紫花苜蓿MsGAI的克隆、表达及遗传转化
    张涵,王学敏,刘希强,马琳,温红雨,王赞
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 201-214.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.002
    摘要 ( 157 )?? HTML ( 25 )?? PDF (8066KB) ( 125 )?? 收藏
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    【目的】 DELLA蛋白属于GRAS家族,是赤霉素信号转导途径中重要的转录因子,负向调节GA转导途径。克隆获得紫花苜蓿GAI,分析其基因生物信息学特征并预测蛋白结构域。明确紫花苜蓿GAI组织表达特征及不同处理下的表达模式,构建该基因超表达载体并转入紫花苜蓿,以探究DELLA蛋白基因在紫花苜蓿赤霉素(GA)信号转导途径及胁迫条件下的作用机理。【方法】 利用同源克隆的方法,从紫花苜蓿中克隆得到MsGAI。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA7.0对MsGAI蛋白序列及同源序列进行多序列比对,构建同源物种间的系统发育树。利用实时荧光定量PCR检测紫花苜蓿各组织GAI表达量以及在PEG、NaCl、GA、ABA和黑暗处理下,GAI的表达变化。同时对转基因GAI株系表达水平进行分析,选择表达量高、中、低株系(L5、L8、L11)分别进行PEG和NaCl处理,分析GAI的表达变化。以pBI121为基础载体,采用双酶切-连接的方法构建植物超表达载体35S:MsGAI-gus。将重组载体转入农杆菌GV3101菌株中,以紫花苜蓿叶片为外植体,采用农杆菌介导的愈伤组织转化法转化紫花苜蓿,经PCR检测和GUS组织化学染色,得到转基因阳性苗。【结果】 该基因序列包含有一个1 818 bp的开放阅读框,编码605个氨基酸。生物信息学分析结果显示,MsGAI蛋白具有GRAS家族的典型结构域和保守区,其中包含N端保守结构域DELLA和TVHYNP,C端保守结构域SAW。多序列比对及系统进化树分析表明,该序列与其他物种的DELLA蛋白序列相似度均高达80%以上,将其命名为MsGAI。该基因与蒺藜苜蓿GAI亲缘关系最近,其次与鹰嘴豆、红三叶等双子叶豆科植物亲缘关系较近,与大麦等单子叶植物较远。实时荧光定量PCR分析表明,MsGAI在紫花苜蓿各组织中均有表达,根中的表达量最高。经PEG、NaCl、GA以及ABA处理后,均有明显响应;黑暗处理显着抑制MsGAI的表达。转基因株系经PEG、NaCl处理后,GAI表达量均上调。对构建完善的35S:MsGAI-gus植物超表达载体进行双酶切检测,琼脂糖凝胶电泳显示,条带大小与预期一致。对转基因植株进行GUS组织染色验证,结果表明,阳性植株呈现蓝色,对照组为白色。对超表达载体携带的MsGAIGUS序列进行PCR检测均呈阳性。【结论】 紫花苜蓿DELLA蛋白基因的克隆和超表达载体构建成功,MsGAI对逆境胁迫有响应。

    耕作栽培·生理生化·农业信息技术
    南方稻区优良食味与高产协同的单季晚粳稻品种特点研究
    胡蕾,朱盈,徐栋,陈志峰,胡兵强,韩超,裘实,吴培,张洪程,魏海燕
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 215-227.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.003
    摘要 ( 139 )?? HTML ( 20 )?? PDF (421KB) ( 165 )?? 收藏
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    【目的】 旨在探究南方稻区不同食味值水平和产量类型单季晚粳稻产量与品质的差异,阐明南方稻区优良食味与高产协同的单季晚粳品种所具有的特征特性。【方法】 本文以南方稻区48个单季晚粳为材料,根据产量和食味值将其分为味优高产、味优中产、味中高产和味中中产4种类型,以实际生产需求为依据,选用味优高产、味优中产和味中高产3种类型进行产量和品质的比较研究。【结果】 味优高产类型的食味值比味中高产类型高26.69%,且味优类型食味值中的外观、黏度和平衡度分别比味中类型高出38.81%、36.30%和37.40%。与味中高产类型相比,味优高产类型的糙米率、整精米率与垩白粒率、垩白度分别高0.34%、7.13%、40.39%和47.56%;胶稠度长度长19.92%;直链淀粉、蛋白质含量低37.67%和33.08%。与味优中产类型相比,味优高产类型的每穗粒数、结实率、千粒重、灌浆结实期的日照时数、成穗率以及抽穗至成熟阶段生物积累量占总生物量的比例分别高4.47%、3.29%、5.72%、16.25%、11.09%、21.49%;叶面积衰减率低13.51%。抽穗至成熟阶段,味优高产的群体生长率、净同化率和光合势比味优中产分别高出24.46%、14.62%和19.01%。【结论】 南方优良食味与高产协同的单季晚粳品种的特征为加工品质达国标1级;透明度等级在3级;垩白粒率和垩白度分别在50%—85%与20%—35%;直链淀粉含量、蛋白质含量与胶稠度长度分别在10.0%、8.0%与90.0 mm左右;RVA谱特征值中消减值在-500cP以下,回复值在550 cP—650 cP。产量构成中,味优高产类型品种的结实率在90.0%左右;千粒重在25.0 g以上;且在抽穗前期保持适宜的干物质积累,在抽穗期以后保证叶面积指数、干物质积累量及其所占全生育期的积累比例有较高的水平。

    青稞抗倒伏性状的基因型差异
    白羿雄,姚晓华,姚有华,吴昆仑
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 228-238.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.004
    摘要 ( 92 )?? HTML ( 16 )?? PDF (370KB) ( 109 )?? 收藏
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    【目的】 倒伏是影响青稞生产和产量的主要原因之一。筛选与青稞抗倒伏性密切相关的性状并构建抗倒伏评价体系,是开展青稞抗倒伏品种选育的重要理论依据。【方法】 通过对35份青稞种质资源根系、茎秆和穗部23个农艺性状进行方差分析,明确不同基因型间各性状的差异性。采用相关分析筛选出与青稞抗倒伏性密切相关的指标,并通过主成分分析和线性回归分析构建完成青稞抗倒伏评价体系。【结果】 不同基因型青稞材料在同一性状间表现出较大差异,且农艺性状在基因型间的差异均极显着,农艺性状中倒伏率的遗传变异最丰富;同一参试材料的农艺性状在两个生态区间差异较大,海北高寒生态区试点各基因型的遗传变异较丰富;各性状的基因型与环境因素间存在显着互作效应(P<0.05)。相关分析结果表明茎秆强度同青稞抗倒伏性关系最为密切,并通过抗倒伏指标构建青稞抗倒伏评价体系。青稞分蘖数过多、第三和第四茎节过长易引起植株倒伏。根干重大、茎秆重、茎秆壁厚、茎秆强度大是植株固持能力强、抗倒伏伏性优异的原因。【结论】 分蘖数、穗重、茎长、茎重、茎秆强度适合作为青稞抗倒伏性评价指标,验证结果表明抗倒伏评价体系较可靠,可用于青稞种质的抗倒伏性评价。

    植物保护
    侵染我国主要蔬菜作物的病毒种类、分布与发生趋势
    刘勇,李凡,李月月,张松柏,高希武,谢艳,燕飞,张安盛,戴良英,程兆榜,丁铭,牛颜冰,王升吉,车海彦,江彤,史晓斌,何自福,吴云锋,张德咏,青玲,严婉荣,杨学辉,汤亚飞,郑红英,唐前君,章松柏,章东方,蔡丽,陶小荣
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 239-261.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.005
    摘要 ( 246 )?? HTML ( 30 )?? PDF (651KB) ( 258 )?? 收藏
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    【目的】 对我国茄科、葫芦科、豆科和十字花科蔬菜主要病毒病开展调查、诊断,明确当前我国主要蔬菜作物病毒病的病原物、优势病毒及其分布,并对其中一些重要病毒引起的病毒病在我国的发生危害趋势进行分析。【方法】 2013—2017年,对我国大陆31个省(市、自治区)开展茄科、葫芦科、豆科和十字花科等蔬菜作物主要病毒病发生情况的普查,利用血清学和分子生物学相结合的方法对主要蔬菜病毒病的病原进行鉴定。【结果】 我国大陆31个省(市、自治区)共采集茄科、葫芦科、豆科和十字花科蔬菜作物疑似病毒病样品41 653份,共检出病毒63种,其中茄科蔬菜检出病毒达40种,葫芦科蔬菜检出病毒26种,豆科蔬菜检出病毒19种,十字花科蔬菜检出病毒14种。茄科的辣椒检出病毒33种,番茄检出病毒25种;葫芦科的南瓜检出病毒22种,黄瓜检出病毒19种;豆科的豇豆检出病毒14种,菜豆检出病毒12种;十字花科的萝卜检出12种病毒,大白菜检出7种病毒。蔬菜作物中普遍存在多种病毒复合侵染现象,已发现2—6种病毒复合侵染,以2种病毒复合侵染类型居多,其中辣椒、番茄和茄子上存在6种病毒复合侵染。本研究首次在国内发现番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV)、西葫芦虎纹花叶病毒(Zucchini tigre mosaic virus,ZTMV)、辣椒脉黄化病毒(Pepper vein yellows virus,PeVYV)、辣椒隐潜病毒1号(Pepper cryptic virus 1,PCV-1)和辣椒隐潜病毒2号(Pepper cryptic virus 2,PCV-2)的侵染;首次发现ToMMV、甜瓜蚜传黄化病毒(Melon aphid-borne yellows virus,MABYV)、南瓜蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)对辣椒的侵染,首次发现ZTMV对黄瓜、烟草轻绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV)对南瓜的侵染,首次发现番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt tospovirus,TSWV)可以侵染芹菜、曼陀罗、豇豆、豌豆、党参、大丽花、旱金莲、刺天茄等,首次发现红辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)可以侵染红茄,另外还首次发现辣椒和番茄为烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)的新自然寄主。【结论】 黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)和蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)为当前危害我国蔬菜作物的优势病毒,在全国范围内广泛分布且发生严重,特别是CMV发生最为普遍,在31个省(市、自治区)均有分布,且均为这些地区的优势病毒。茄科蔬菜的优势病毒为CMV和TMV,葫芦科蔬菜的优势病毒依次为CMV、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)和TMV,豆科蔬菜的优势病毒为CMV和BBWV2,十字花科蔬菜的优势病毒依次为TuMV、CMV和TMV。番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)、TSWV、CGMMV和ToMMV等病毒在部分省区发生严重,扩展蔓延速度极快,具有在全国范围内流行的风险。

    黄淮海夏玉米主产区茎腐病主要病原菌及优势种分析
    刘树森,马红霞,郭宁,石洁,张海剑,孙华,金戈
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 262-272.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.006
    摘要 ( 93 )?? HTML ( 8 )?? PDF (406KB) ( 133 )?? 收藏
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    【目的】 明确黄淮海夏玉米主产区玉米茎腐病的主要病原菌组成及优势种,为病原菌致病机制、抗性育种及茎腐病防治提供依据。【方法】 于2014—2017年采集黄淮海夏玉米主产区3个省(河北、河南、山东)的玉米茎腐病样本850份。通过形态学、通用引物和特异引物对病组织分离物进行鉴定,并采用上述引物直接检测病组织。整合分析分离物鉴定法和组织分子检测法的结果以确定玉米茎腐病的主要病原菌及优势种;分析主要病原菌在各省间以及同一省份不同年度的检出率,揭示主要病原菌的种群动态变化;分析单个样本中病原菌的检出率,探讨多种病原菌的共存模式。【结果】 有667份样本检测出真菌或卵菌,占总样本的78.47%;年度间样本检出率存在差异,2014年的检出率不足50%,而2015—2017年的检出率相近,均高于90%。在所有样本中共检出20属46种真菌或卵菌,其中镰孢菌(Fusarium spp.)的检出率最高,为89.96%,包括禾谷镰孢复合种(F. graminearum species complex)、层出镰孢(F. proliferatum)、拟轮枝镰孢(F. verticillioides)、厚垣镰孢(F. chlamydosporum)、亚粘团镰孢(F. subglutinans)、尖镰孢(F. oxysporum)、黄色镰孢(F. culmorum)、藤仓镰孢(F. fujikuroi)、变红镰孢(F. incarnatum木贼镰孢(F. equiseti)和茄镰孢(F. solani)11个种;腐霉菌(Pythium spp.)的检出率为34.18%,包括芒孢腐霉(P. aristosporum)、禾生腐霉(P. graminicola)、棘腐霉(P. acanthicum)、孤雌腐霉(P. amasculinum)和寡雄腐霉(P. oligandrum)5个种。拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种、芒孢腐霉和层出镰孢为4种主要病原菌,检出率依次为62.07%、46.93%、29.09%和28.04%,其中拟轮枝镰孢为优势种。各省之间,上述4种主要病原菌的检出率存在一定差异。拟轮枝镰孢在河北省的检出率为73.98%,明显高于该菌在河南省和山东省的检出率;禾谷镰孢复合种在3个省的检出率相近;层出镰孢和芒孢腐霉在山东省的检出率分别为35.78%和34.31%,均高于在其他两省的检出率。同一省份不同年度上述4种主要病原菌的检出率呈动态变化,其中任何一种病原菌均有可能上升为优势种。进一步分析表明,单个样本中可以检测出一种或多种病原菌,检测出1种菌的样本占38.38%,检出2种和3种病原菌的样本分别占29.24%和19.04%;2种及以上病原菌共存以镰孢菌和腐霉菌、镰孢菌和镰孢菌模式为主。【结论】 黄淮海夏玉米主产区茎腐病主要病原菌为拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种、芒孢腐霉和层出镰孢,其中拟轮枝镰孢为优势种;拟轮枝镰孢在河北省的检出率最高,层出镰孢和芒孢腐霉在山东省的检出率最高,禾谷镰孢复合种在3个省的检出率相近;单个样本中存在多种病原菌共存的模式。

    土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境
    基于GWR模型的渭北黄土旱塬粮食单产空间分异 及其影响因子分析——以陕西彬县为例
    邱孟龙,曹小曙,周建,冯小龙,高兴川
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 273-284.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.007
    摘要 ( 60 )?? HTML ( 7 )?? PDF (2184KB) ( 67 )?? 收藏
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    【目的】 通过探究渭北黄土旱塬区粮食单产在县域尺度上的空间分异特征及其影响因子,为小尺度粮食单产及其影响因子的空间分异研究、区域粮食单产提高提供科学依据。【方法】 应用空间自相关、最小二乘法和地理加权回归模型(GWR),研究渭北黄土旱塬区典型粮食主产县陕西彬县粮食单产的空间分布特征及其影响因子的空间分异。【结果】 彬县粮食单产的Moran’s I指数为0.328,显着性检验的Z值为5.51,呈北高南低的局部空间集聚特征。坡度、耕层厚度、土壤有机质、道路密度和施肥成本对彬县粮食单产具有正向影响,土壤类型、侵蚀程度和地下水埋深对彬县粮食单产具有负向影响,各解释变量回归系数的相对极差范围为0.55—14.11。空间上,耕层厚度、土壤类型、侵蚀程度、土壤有机质和道路密度对彬县南部、东南部梁峁丘陵沟壑区粮食单产的影响强于北部黄土旱塬区,而坡度、地下水埋深和施肥成本则表现出相反的空间非平稳性特征。OLS模型回归系数的显着性与GWR模型回归系数的相对极差呈负相关关系。GWR模型的R 2比OLS模型提高了0.04,AIC值减少了11.04。 【结论】 彬县粮食单产之间存在显着的空间正相关关系;土壤有机质、施肥成本和地下水埋深是渭北黄土旱塬区县域粮食单产的最主要影响因子;同一影响因子在县域内的不同空间位置对粮食单产的影响程度存在较大差异,且各影响因子对粮食单产影响程度的空间非平稳性是导致OLS模型回归系数显着性水平较低的主要原因。GWR模型在空间非平稳性数据建模方面的解释能力与估计精度都优于OLS模型,且能够实现模型估计参数的空间可视化。

    不同用量风化煤腐殖酸对玉米根系的影响
    周丽平,袁亮,赵秉强,李燕婷,林治安
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 285-292.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.008
    摘要 ( 92 )?? HTML ( 13 )?? PDF (487KB) ( 113 )?? 收藏
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    【目的】 我国风化煤腐殖酸储量丰富,腐殖酸含有多种活性官能团,其对植物生长发育具有重要意义。当腐殖酸施于土壤时,根系对腐殖酸的响应是促进植物生长的最初动力。因此,研究腐殖酸对玉米根系生长发育的影响机制,可为风化煤腐殖酸资源的高效利用和作物的增产提质提供理论依据。【方法】 采用霍格兰营养液溶液培养试验,供试玉米品种为郑单958,待玉米幼苗长至两叶一心时移到营养液培养盆钵中缓苗1 d,外源添加不同添加量(0、5、10、15和20 mg C·L -1)腐殖酸,研究其对玉米生物量、根冠比、根系形态以及根部养分状况的影响。 【结果】 (1)腐殖酸可显着增加玉米根系和地上部干物质量、根冠比、根系活力和根系TTC还原总量,较对照分别平均提高42.31%、19.33%、18.18%、46.54%和81.01%。(2)腐殖酸可改善玉米根系的形态,其处理玉米总根长、总根数量、根体积、根表面积和平均直径分别比对照平均提高13.51%、16.74%、69.62%、14.68%和49.28%。(3)添加腐殖酸可增加玉米根系的轴根数、轴根长度和侧根数,腐殖酸处理分别比对照提高16.28%、21.65%和16.80%。(4)随腐殖酸添加量的增加,对玉米根系生长的促进作用呈现先升高后降低的变化,以中等浓度(10 mg C·L -1)腐殖酸对玉米根系的作用效果最明显,其根干物质量和根系活力分别比对照提高了69.36%和69.07%。(5)腐殖酸处理(尤其是10 mg C·L -1)可有效增加玉米根系糖类、碳水化合物、脂类物质、蛋白质、多肽和氨基酸类物质等的含量。 【结论】 添加腐殖酸可明显增加玉米干物质量和根系活力,增加根冠比,改善根系形态,有效增加玉米根系主要化学组分的含量。本试验条件下,中等浓度(10 mg C·L -1)的腐殖酸对玉米根系的促进作用最好。

    磷石膏农用的环境安全风险
    王小彬,闫湘,李秀英,冀宏杰
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 293-311.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.009
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    磷石膏是湿法磷酸生产过程中产生的工业废渣,是化学工业中排放量最大的固体废物之一。中国从20世纪50年代末开始发展磷复肥产业,但生产中排放的磷石膏废渣堆积量不断增加。为解决大量磷石膏堆存造成的环境问题,目前,磷石膏被再次利用作建筑材料,如用于生产水泥缓凝剂和制作石膏建材,以及用于充填矿坑和筑路等。自20世纪90年代也有研究尝试利用磷石膏替代天然石膏改良盐碱化土壤。然而,磷矿石中多种有害元素在湿法磷酸生产过程中残留或富集在磷石膏中,导致磷石膏中重金属、氟化物(F)及放射性元素镭( 226Ra)等污染元素含量较高,且存在不同程度超出国家土壤环境质量标准和地下水质量标准。如磷石膏中重金属Cr、As、Cd和Hg超过《土壤环境质量-农用地土壤污染风险管控标准》(GB 15618—2018)的农用地土壤污染风险筛选值的比率为20%—67%;且检出Hg、Cd、Pb、Ni、Cr和Be浸出浓度超过《地下水质量标准》(GB/T 14848—2017)中IV—V类水质标准。磷石膏中氟含量已超出中国地氟病发生区土壤全氟和水溶氟临界值的比率分别为89%和100%;且检出其浸出浓度远超出地下水V类水质标准,部分已超过《危险废物鉴别标准-浸出毒性鉴别》(GB 5085.3—2007)浸出限量。按照农用地土壤污染风险筛选值(GB 15618—2018),估算了磷石膏在不同施用量条件下带入土壤的污染物元素累积量超出农用地土壤污染风险筛选值所需要的年限,表明短期内即可能导致土壤中污染元素累积量超标,如在年投入量为22.5 t·hm -2条件下(如污染元素淋溶量忽略不计),对污染元素Cd、Hg、F和 226Ra而言,无污染土壤变为污染土壤的年限分别约为1、5、4和25年。已有田间试验显示,磷石膏农用可导致部分农产品中有害元素(如F、As、Cd、Hg、Pb和Zn等)超标。2017年国家出台的《固体废物鉴别标准 通则》(GB 34330—2017)明确规定,生产过程中产生的副产物,包括在无机化工生产过程中产生的磷石膏等属于固体废物;且以土壤改良、地块改造、地块修复和其他土地利用方式直接施用于土地的固体废物,仍然作为固体废物管理。为保证土壤健康、食品安全和环境安全,建议未经无害化处理、有害元素超标的、存在环境安全风险的工业固废磷石膏不得以土地处置方式为由直接施用于农田土壤,以免污染物进入食物链而危害人类健康。

    园艺
    Adβgal-1Adβgal-2克隆及其在猕猴桃果实软化中的作用
    冯新,赖瑞联,高敏霞,陈文光,吴如健,陈义挺
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 312-326.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.010
    摘要 ( 76 )?? HTML ( 4 )?? PDF (11264KB) ( 53 )?? 收藏
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    【目的】 β-半乳糖苷酶是一类参与细胞壁降解的糖苷酶,在植物的生长发育和果实成熟软化过程中发挥重要作用。通过对猕猴桃2个β-半乳糖苷酶基因的鉴定及其表达模式研究,明确它们在猕猴桃果实软化中的作用,丰富猕猴桃的后熟软化机理研究。【方法】 以‘米良1号’猕猴桃为试材,采用RT-PCR法扩增果实的β-半乳糖苷酶基因,利用在线数据库分析其编码蛋白的特性、功能结构域、系统进化关系、基因结构和调控miRNA,应用qPCR研究其在不同组织部位、果实的不同软化时期、不同贮藏温度和ABA处理后的表达特征,并结合酶活性变化,阐释这2个β-半乳糖苷酶基因在猕猴桃果实软化中的作用。【结果】 克隆得到2个猕猴桃β-半乳糖苷酶基因(Adβgal-1Adβgal-2),登录号分别为MH319788和MH319789。Adβgal-1的开放阅读框为2 280 bp,编码759个氨基酸;Adβgal-2的开放阅读框为2 025 bp,编码674个氨基酸。结构域分析显示,Adβgal-1和Adβgal-2均含有植物糖苷水解酶家族35的功能结构域(Glyco_hydro_35)。基因结构分析表明,Adβgal-1由18个外显子和17个内含子组成,而Adβgal-2由17个外显子和16个内含子组成。进化树分析显示它们位于两个不同的进化分支中,且序列差异较大,可能源自不同的基因祖先。qPCR分析结果表明,Adβgal-1Adβgal-2在猕猴桃的各组织部位(根、茎、叶、花、幼果、成熟果)均有表达,但表达水平不同;它们均在果实软化初期上调表达,随着果实硬度的下降,表达量持续增加;在25℃贮藏过程中,它们均在3 d时上调表达,随着时间的推移,表达量增加;而在4℃贮藏过程中,Adβgal-1的表达受到抑制,Adβgal-2的表达呈波浪式;ABA处理诱导Adβgal-1Adβgal-2的表达。酶活性测定结果显示,β-半乳糖苷酶活性在果实软化初期略有降低,随着果实硬度的下降逐渐升高。【结论】 Adβgal-1Adβgal-2均参与猕猴桃果实的软化进程。不同贮藏温度和ABA处理对猕猴桃果实软化的影响可能是通过改变β-半乳糖苷酶基因的表达而实现的。

    基于掩模及亮度校正算法的脐橙表面缺陷分割
    张明,李鹏,邓烈,何绍兰,易时来,郑永强,谢让金,马岩岩,吕强
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 327-338.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.011
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    【目的】 本研究旨在有效解决果皮有缺陷的水果图像在去除背景时部分缺陷被误分割为背景,以及水果表面缺陷难以有效分割提取的问题。【方法】 以I分量图来构建掩模模板,根据其灰度直方图信息,通过双峰法选择单一阈值(T=75)分以纽荷尔脐橙为研究对象,提出基于HSI颜色空间模型法去除背景割背景并填充孔洞得到掩模模板Imask,然后掩模模板ImaskI分量图通过点乘运算得到去除背景的I分量图;提出基于多尺度高斯函数图像亮度校正算法对去除背景后的I分量图像进行亮度校正,通过构建多尺度高斯函数滤波器,将去除背景后的I分量图与构建的多尺度高斯函数进行卷积运算即得到去除背景后的I分量图像表面光照分量图,最后将去除背景后的I分量图与得到的光照分量图进行点除运算即得到去除背景后的I分量图像亮度校正图;然后采用单一全局阈值法对脐橙表面缺陷进行提取。【结果】 基于HSI颜色空间模型法去除背景,可在有效去除背景的同时完好保留脐橙的表面信息,有利于后续操作;基于多尺度高斯函数的图像亮度校正算法分别对6种常见脐橙缺陷进行图像亮度校正后采用单阈值法提取缺陷,使不同灰度等级的脐橙表面缺陷一次性分割成功,其中分割率最高为100%,最低为88.5%,整体达92.7%。通过试验分析后发现造成部分误分割或漏分割的原因主要在于部分缺陷果缺陷处颜色较轻,与正常区域灰度差较小,从而造成漏分割;还有部分缺陷果由于缺陷面积小,在图像形态学处理过程被误认为是噪声而被去除;同时发现正常果的误判率也达到了10.8%,经分析发现误判的正常果表皮组织区域的褶皱位于图像的边缘区域,从而被误认为是边缘区域的缺陷,导致误判。【结论】 基于HSI颜色空间模型法去除背景及基于多尺度高斯函数的图像亮度不均校正算法对纽荷尔脐橙图像背景分割和去除背景后的I分量图像表面亮度校正均取得了较好的效果,能有效识别脐橙缺陷区域,为脐橙精确分级提供了技术支持,也为其他果品表面缺陷快速检测提供了一种新思路。

    食品科学与工程
    挤压协同酶法制备高粱蛋白ACE抑制肽及其稳定性
    周剑敏,尹方平,于晨,汤晓智
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 339-349.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.012
    摘要 ( 60 )?? HTML ( 4 )?? PDF (507KB) ( 36 )?? 收藏
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    【目的】 利用挤压协同酶法制备高粱蛋白ACE抑制肽,为提高高粱蛋白资源的利用效率提供参考。【方法】 以高粱粉为原料,先经挤压处理,再经淀粉酶酶解,最后通过碱性蛋白酶酶解,获得高粱蛋白ACE抑制肽。研究物料水分、挤压温度和淀粉酶活力对高粱蛋白酶解液的水解度和ACE抑制活性的影响,并探讨高粱蛋白ACE抑制肽的稳定性。【结果】 随着物料水分含量和挤压温度的增加,挤压过程中单位机械能耗(SME)逐渐降低。在挤压环境下,高粱中淀粉和蛋白质的相互结合变得松散,淀粉-蛋白质包埋体系被破坏;同时高粱中球形蛋白质体被打破,提高所获得高粱蛋白的酶敏感性,在碱性蛋白酶的作用下生成更多具有抑制活性的短肽。挤压过程中物料水分含量和挤压温度以及α-淀粉酶活力对高粱蛋白酶解液的水解度和ACE抑制率有显着影响。随着物料水分的增加,蛋白质分子的聚合程度下降,使得高粱蛋白酶解液的水解度和ACE抑制率随之增加,当物料水分增加至19%后,挤压过程对蛋白质周围的淀粉分子的破坏作用降低,水解度和ACE抑制率的上升趋势趋于平缓;当挤压温度从120℃增加至180℃时,高粱内部的蛋白质-淀粉包埋体系破坏加剧,同时蛋白质的空间结构在高温作用下的变性程度加大,高粱蛋白酶解液的水解度由7.42%增加至11.06%,同时高粱蛋白ACE抑制肽的抑制率也由46.57%增加至53.41%;挤压后高粱粉经α-淀粉酶处理,进一步去除包裹在蛋白质周围的淀粉,发现随着α-淀粉酶活力的增加,高粱内部的蛋白质-淀粉包埋体系破坏程度加剧,为制备高粱蛋白ACE抑制肽提供更多原料,导致高粱蛋白酶解液的水解度和ACE抑制率随之增加,当α-淀粉酶活力增加至2.0 U·g -1时,淀粉酶与淀粉结合达到饱和状态,水解度和ACE抑制率趋于稳定。高粱蛋白ACE抑制肽经温度和酸碱处理后,ACE抑制活性在68.1%—71.31%,保持了良好的抑制活性;高粱蛋白ACE抑制肽在体外经胃肠道酶系消化酶解后,ACE抑制活性均高于73%,依然保持了较强的ACE抑制活性,说明挤压协同酶法制备的高粱蛋白ACE抑制肽具有长期保存有效性,同时能够在胃肠道消化后保持生物活性。 【结论】 采用挤压协同酶法可以显着提高高粱蛋白酶解液的水解度和ACE抑制肽的活性,同时制备的高粱蛋白ACE抑制肽具有良好的稳定性,为拓宽高粱的利用和制备功能性食品配料提供了一条新途径。

    畜牧·兽医·资源昆虫
    组学技术在奶牛乳房炎上应用的相关研究进展
    李广栋,吕东颖,田秀芝,姬鹏云,郭江鹏,路永强,刘国世
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 350-358.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.013
    摘要 ( 100 )?? HTML ( 19 )?? PDF (392KB) ( 108 )?? 收藏
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    奶牛乳房炎发病率较高、病因复杂,是影响世界奶牛业发展的主要常见疾病之一。由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌等病原体引起的临床和隐形乳房炎对动物性食品安全及畜牧业的正常发展构成巨大安全隐患,全球每年因奶牛乳房炎导致的经济损失多达数十亿美元。近年来随着测序技术的不断突破和测序成本的不断降低,生命科学的研究进入了多组学时代,其在畜牧业中的应用也越来越广泛。对奶牛乳房炎来说,传统的组织病理学筛查、体细胞计数、牛乳pH检测、牛乳电导率检测、酶活检验、红外热显影等诊断技术由于其自身的局限性难以充分全面地阐明其发病机理,已不能满足科研人员的需求。组学技术即Omics,主要包括基因组学技术、蛋白质组学技术和代谢组学技术等。通过基因组学研究不仅能从转录层面上揭示奶牛乳房炎复杂性状的表型变异及遗传基础,还能从转录后调控(miRNAs、LncRNAs等)和表观遗传学修饰(DNA甲基化、组蛋白修饰等)层面挖掘出相关的DNA和RNA变化及多分子间的相互作用规律,能够帮助我们更好地了解奶牛乳腺组织对病原体的免疫应答机制,筛选鉴定出乳房炎抗性的信号通路及关键候选基因,从而提高基因组预测或选择的准确性。利用蛋白质组学技术能够对不同环境不同状态的牛乳及乳腺组织的蛋白质种类、表达丰度、蛋白互作、翻译后修饰等进行比较分析,对差异表达的蛋白质经过COG功能注释、数据库比对、GO和Pathway富集分析,可以从蛋白水平揭示乳房炎发生及防御过程中的复杂调控机制,同时还能发现乳房炎诊断的标记分子,进而为乳房炎治疗药物的研发提供潜在的精准靶点。代谢组学是系统生物学的重要组成部分。通过代谢组学研究,能够同时对机体在内、外环境等复杂因素作用下及特定生理时期内所有低分子量代谢产物(如氨基酸、脂类、碳水化合物等)进行精准、高效的定性和定量分析,从而阐明相关的代谢途径;其作为基因表达的最下游,能使基因和蛋白质表达的微小变化在代谢物水平上得到放大,进而可以更充分地反映细胞功能。将代谢组学技术应用到奶牛乳房炎研究中,能够分析出差异代谢物、鉴定出相关的生物标志物,进而揭示奶牛乳腺的生理及病理变化过程。总之,将各组学技术及多组学整合关联分析应用到奶牛乳房炎研究中可以更深入地揭示其病原防御机制,进而为乳房炎的预测、诊断和治疗提供有价值的参考和借鉴。本文就最近几年组学技术在奶牛乳房炎领域的研究进展进行综述,以期为我国奶牛健康及奶业安全发展提供指导。

    奶牛用头孢洛宁乳房注入剂(干乳期)的安全性评价
    华伟毅,刘义明,徐飞,路永强,孔梅,王海挺,黄慧丽,王宏磊,吴连勇,李秀波
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 359-366.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.014
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    【目的】 确定自主研发新兽药——头孢洛宁乳房注入剂(干乳期)对靶动物的安全性。【方法】 选择经产和初产健康泌乳期奶牛各6头,入选前30日内未接受过全身性或乳房内抗生素给药,产奶量在15-35 kg。给药前1日、给药当日(0日),记录各试验奶牛的日产奶量、直肠温度,并采集奶样进行体细胞检测。采样时先用清水冲洗乳房,用75%乙醇对乳头及周围进行消毒,待酒精挥发后,手工挤奶,弃去前三把奶后,采集奶样于灭菌试管中,贴好标签,低温(4℃)保存并于6 h内送实验室检测。给药当天,待奶牛挤完奶后,先用消毒毛巾清洁各乳区,再用消毒药液浸泡乳头约30 s,然后进行乳头内灌注给药。灌注时轻轻推压活塞,将药物缓缓注入乳池内,使药物均匀分布。按照推荐剂量,每头奶牛的4个乳区分别单次注入头孢洛宁乳房注入剂(干乳期)一支(含头孢洛宁250 mg)。给药后1日、3日、5日、7日和10日对4个乳区各采集奶样。记录奶牛标识、观察时间、试验日期和时间、每头奶牛日产奶量及体温等参数。检测乳样中体细胞数(SCC),对给药当日(0日)和给药后第10日各采集的乳样进行细菌学检查。将各奶样接种至选择性培养基分离各种病原菌。分离菌株经纯化培养后,依据菌落形态、染色特征、生化特点鉴定其种类。主要分离金黄色葡萄球菌、链球菌(无乳链球菌、乳房链球菌)、大肠杆菌。【结果】 在整个试验期间,给药乳区未出现乳房红、肿、热、痛等临床症状。给药前1日、0日和给药后的1、3、5、7和10日,体细胞数大多在25-40万个/mL,平均体细胞数分别为33.26、32.74、32.70、31.63、31.24、30.62、30.04 万个/mL,给药后各时间点奶样体细胞数与给药前体细胞检测结果相比,体细胞数有所降低,但经重复测量方差分析显示无显着性差异(P>0.05);日产奶量在23-33 kg,平均日产奶量分别为27.30、27.35、27.25、27.40、27.64、27.83、28.00 kg,经重复测量方差分析显示无显着性差异(P>0.05);所有试验奶牛在给药前和给药后不同时间点的直肠温度均在奶牛的正常温度范围内(38.4-39.2℃),直肠平均温度分别为38.79、38.82、38.83、38.77、38.71、38.71、38.69℃,经重复测量方差分析显示无显着性差异(P>0.05);故按推荐剂量单次给药对奶牛的体细胞数、日产奶量、体温无显着影响。病原菌鉴定结果表明:在给药当日(0日)采集的乳样中,分离到链球菌、葡萄球菌和大肠杆菌分别为2、3和4株;给药后第10日,仅检测到葡萄球菌和链球菌各1株,给药前后目标菌数量有显着降低。【结论】 头孢洛宁乳房注入剂(干乳期)对奶牛体温、产奶量和奶中体细胞数等无不良影响,该制剂用于奶牛安全。

    头孢洛宁乳房注入剂(干乳期)在牛奶中的残留消除
    闫超群,李帅鹏,张申,谢顺,魏开赟,黄显会
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 367-375.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.015
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    【目的】 头孢洛宁为第一代半合成头孢菌素类抗生素,对革兰氏阳性菌和阴性菌均有良好的抗菌活性,临床以每个乳区250mg用于治疗亚临床感染引起的乳房炎。头孢洛宁通过与敏感菌的青霉素结合蛋白相结合,从而阻断细菌细胞壁的合成,达到抑制细菌生长的目的。笔者开展头孢洛宁乳房注入剂(干乳期)在牛奶中的残留消除规律研究,以期为该药的合理使用和乳品安全生产提供指导。【方法】 选取20头进入干乳期的健康奶牛,每个乳区分别注入一支头孢洛宁乳房注入剂。平均干乳期为50 d,奶牛产犊开始泌乳后的6、12、24、36、48、60、72、96和120 h,将每头奶牛每次采集的4个乳区的奶混合。采用Phenomenex Luna C18(150mm×2.1mm,3.5μm)。以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱程序洗脱,流速0.25 mL/min,柱温为35℃,进样量为5.0 μL。头孢洛宁采用电喷雾离子源(ESI)离子化,正离子模式扫描,多反应监测模式(MRM),电喷雾电压(IS)为4kV,雾化气压力(GS1)为55psi,气帘气(CUR)为15 psi,辅助气流速(GS2)为35psi,离子源温度(TEM)为600 ℃;定量离子对为m/z→459.4/337.3。样品自然解冻,取5 g牛奶,置于50 mL离心管中,加入20 mL乙腈,涡旋混匀2min,在10℃条件下10 000 r/min离心10 min。将上清液用15 mL75%乙腈水溶液重复提取一次,合并两次的提取液,并加入10 mL乙腈饱和的正己烷,震荡1 min,弃掉正己烷,把提取液移至100 mL鸡心瓶中,在40℃用旋转浓缩仪旋转蒸发除去乙腈。向已除去乙腈的样品溶液中加入20 mL磷酸二氢钠缓冲溶液,然后用氢氧化钠溶液调节至pH8.5。将样品提取液以3 mL/min的流速通过HLB固相萃取柱,先用5 mL磷酸二氢钠缓冲溶液洗涤鸡心瓶并过柱,再用2 mL水洗柱。用2 mL乙腈洗脱,收集洗脱液于刻度样品管中,在40℃下用氮气浓缩仪吹干,用2 mL水溶解残渣,摇匀后,过0.22 μm滤膜,取样供LC-MS/MS检测。【结果】 头孢洛宁在2—200 μg·kg -1的范围内呈良好的线性关系,相关系数在0.991—0.997之间。该方法检测限为0.5 μg·kg -1,定量限为2 μg·kg -1。头孢洛宁在2、20、40和200 μg·kg -1四个添加水平上的平均回收率为73.60%—103.52%,批内变异系数为1.85%—10.41%,批间变异系数为3.41%—8.97%。结果表明,该方法的回收率和变异系数满足残留检测定量分析要求。使用头孢洛宁干乳期乳房注入剂的初产奶牛,在产犊后96 h低于定量限。经产奶牛在产犊36 h低于定量限,24h均低于MRL。 【结论】 头孢洛宁乳房注入剂(干奶期)按推荐剂量4个乳区(250 mg/乳区)给药后,其产犊泌乳后牛奶中的弃奶期为24 h。

    家蚕热休克蛋白HSP60相互作用蛋白筛选与鉴定
    董战旗,蒋亚明,潘敏慧
    中国农业科学. 2019, 52(2):? 376-384.? doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.016
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    【目的】 HSP60是热休克蛋白中重要的一员,在昆虫先天性免疫过程中起重要作用,同时也是昆虫生长发育的必要因子。前期研究证明家蚕BmHSP60参与家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)入侵细胞过程,本研究通过鉴定BmHSP60相互作用蛋白,为其在家蚕先天性免疫中作用机制研究打下基础。【方法】 利用免疫共沉淀和银联-质谱分析技术(LC-MS/MS),首先构建BmHSP60过表达载体并融合Flag标签,转染到家蚕细胞中48 h后,收集蛋白,进行免疫共沉淀,用Flag抗体孵育磁珠调取相互作用蛋白,银染处理后,能够检测到明显的差异条带,把差异条带切胶保存在-80℃,然后质谱分析差异条带的多肽;根据质谱结果和差异条带的大小与NCBI数据库进行比对,筛选到候选相互作用蛋白。最后,构建候选相互作用蛋白的克隆载体并融合HA标签,分别和BmHSP60表达载体共转到家蚕细胞,免疫共沉淀和荧光共定位验证BmHSP60和候选蛋白之间的相互作用。并通过Mito-Tracker-Green分析BmHSP60候选相互作用蛋白与线粒体的共定位。【结果】 免疫共沉淀银染结果显示BmHSP60相互作用蛋白在110、90、75、60和35 kD附近有5条明显的差异条带,将这5条条带混成蛋白池进行质谱分析,通过银联-质谱分析结果和家蚕基因组数据库以及NCBI数据库进行比对分析共鉴定到32个差异蛋白,根据多肽数量和蛋白分子量的大小共筛选到5个相互作用候选蛋白与银染结果差异条带一致,分别为ADP/ATP translocase(ANT)、Actin、Alpha-tubulin、Elongation factor 1-alpha(EF1α)和HSP90。构建BmHSP60候选相互作用蛋白克隆表达载体并融合HA标签,与BmHSP60共同转染到家蚕细胞,免疫共沉淀immunoprecipitated(IP)用α-Flag抗体孵育,immunoblotting(IB)再用α-Flag抗体孵育,均能够检测到BmHSP60表达。而IB用α-HA抗体孵育显示只有BmANT和BmHSP90能够检测到相应的条带,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有检测到相应的条带,说明只有BmANT和BmHSP90与BmHSP60具有直接的相互作用,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有相互作用。通过荧光共定位进一步分析表明BmANT和BmHSP90能够与BmHSP60共定位在细胞质中。线粒体标记物Mito-Tracker-Green共定位结果显示BmHSP60、BmANT和BmHSP90均能够与线粒体共定位到一起。【结论】 鉴定到家蚕热休克蛋白BmHSP60能够与BmANT和BmHSP90相互作用,并共定位于线粒体,可用于研究BmHSP60在家蚕抗病毒免疫中的作用机制。